提高桑树染色体观察效果的体会

张韬   翁荣林
(苏州蚕专)


  在桑树方面,国内自六十年代以来,曾有人报导过以根尖和花粉母细胞作材料,进行了染色体观察和制片技术方面的研究。为了克服取样和观察的盲目性,提高观察效果和制片质量,在前人的基础上,我们于一九八O年至一九八一年对桑树材料、温度和固定、染色、制片等问题作了进一步的摸索。现将观察方法和所得的体会叙述如下;以供参考。

              一、材料与方法

  (-)材料:用嫁接过的一十五年湖桑三十二号高干桑很尖;桑子胚根;硬枝及绿枝扦插苗的愈伤根;桑茎生长点和花粉母细胞等六种不同材料,比较细胞染色体观察效果。
  (二)材料准备:桑树根尖:( 1)在桑树生长季节,用铁铲挖去桑树周围泥土,然后用镊子镊取白色幼嫩根尖。
  (2)在桑树行间,铺成三至四寸厚的黄砂,经常保持湿润,待二十至三十天后,即能
取到要求的根尖。
  (3)桑子根尖:用温箱催芽法,摄氏温度二十八至三十,三至四天后即能取到长约零
点五厘米的的根尖。
  (4)愈伤根:用湖桑三十二号的枝条,剪成长5寸,捆插于温度自控的砂床内,经过
二十五天左右,待其发根后取样。
  2、桑茎生长点:(1)在自然环境中选择生长旺盛的湖桑32号枝条(或新梢),在其顶端用镊子取长约两厘米的嫩头后,剥去生长点上的幼叶。
  (2)新消离体培养:在取新消嫩头前十五小时,剪取长约一尺左右的新消,插在盛有
黄砂的容器内(上面用塑料膜蒙住,以防失水)。然后放在不同的温度中培养,再按不同时间取新消顶部嫩头。
  (3)桑树花粉母细胞:一年生老条进行硬技扦插,保持一定温湿度。待花芽发育到脱
苞中期,采集花药。
  (三)材料处理及染色方法:1、前处理:前处理方法分低温和药物处理。药物三种浓
度,秋水仙碱为:0.l%、0.2%、0.4%水溶液,处理时间三小时;8一羟基喹啉浓度为: 0.001M, 0.002M、 0.004M的水溶液,处理时间四小时。低温处理时,在0一5℃的蒸馏水中保存二十四小时。
  2、固定:选用混合固定液,其配制方法按:卡若氏液(Carnoy'sfuid)和纳氏兴氏液(NaVaschln's F1Ujd)配制法。
  3、水解和染色方法:将材料从固定液中取出,分别依次用95%、80%、70%、50%酒精清洗,直至无酸味为止,再经蒸馏水冲洗十分钟,然后置于1N盐酸中,在60℃ 温度中水浴十分钟左右,尔后立即将材料取出,用水冲洗三至四次。水解冲洗后的材料,选择三种不同的天然染料一海登汉氏(Heidenhain’s)铁苏木精,贝林氏(Belling's)铁醋酸洋红( iron—aceto— Carmine)和地衣红(奥辛, Orcein)进行染色。
  4、脱水透明:采用常规法进行脱水透明,其程序如下:30%酒精2-3分钟5O%酒精12-3分钟70%酒精2-3分钟 85%酒精2-3分钟95%酒精2-3分钟100%酒精2-3分钟石碳酸、二甲苯5分钟二甲苯5分钟中性树胶封片。
  (四)、调查与观察:
  l、材料细胞的大小与染色体清晰度,分散度的关系。
  2、不同材料的取材时间和温度与细胞分裂,染色体清晰度,分散度的关系。
  3、前处理方法与染色体清晰,分散度的关系。
  4、染色剂种类及染色效果的比较。
  5、制片方法。

                 二、结果与体会

  (一)不同材料细胞大小与染色体清晰、分散度的关系。

 


  从上表可知,不同材料之间,细胞大小有明显的差别,总的倾向是,桑树根尖的细胞最大,成长方形和正方形,以长方形为主桑茎生长点细胞其次,呈正方形和长方形,以正方形为主桑树花粉母细胞最大,呈椭圆形或圆形,以椭圆形为主。
  经镜检观察桑树根尖细胞染色体的清晰,分散度较桑茎生长点好,但差别不是太大,这可能是桑树根尖细胞较桑茎生长点细胞大的缘故。
  二、材料种类、取材时间和温度与细胞分裂及染色体清晰,分散度的关系。
  1、取材时间:
  我们用下列四种材料,在摄氏二十五度温度下,从上午八点到十一点,每小时取样固
定一次,其他处理方法相同,进行压片观察,结果如下:

 


  从上表可以看出,在同一温度下,由于材料不同,细胞分裂旺盛的时间有差异。野外老桑树根尖和桑树花粉母细胞在上午十点左右(即取材适时),细胞分裂数最多。平均每个材料的细胞分裂数分别为八点八和五点八。桑子胚根根尖和茎生长点在上午九点左右(即为取材适时),细胞分裂数最多,平均每个材料的细胞分裂数分别为五十四点五和三十三点四。
  另外由于材料不同,细胞分裂的持续时间也不同。野外桑树根尖,桑子胚根和桑茎生长点从上午八点到一十一点,持续时间长达三小时左右,而花粉母细胞为九点到十点,持续时间只有一小时左右。
  2、时间和温度与细胞分裂的关系
  把不同材料,分别放在 20℃、 25℃、 30℃温度下,从上午八点到十一点,每小时取样一次,用相同的方法固定,染色,观察结果如下:

 

  从上表可以看出:不同材料生长点的细胞分裂最旺盛时间,是随温度而变化的。在20℃时,各种材料细胞分裂旺盛的时间在上午十至十一点,25℃时在上午九至十点,30℃时,在上午八至九点。大体倾向是,以 25℃为中心,温度提高 5℃,取材最适时间提前一个小时,降低5℃,则取材延迟一个小时。但有些材料并无这种倾向,如花粉母细胞,在25℃和 30℃二种温度下,分裂最旺盛的时间都在同一时间里(即上午十点左右。)
  (三)前处理方法与染色体清晰度,分散度的关系。
以桑子胚根为材料(温度25℃),在上午九点取样,取样后分别采用低温,秋水仙碱和8—羟基喹啉处理。然后水解染色(铁矾苏木精),观察结果如下表4。
  从下表4可知,低温处理(I)效果好,染色体分散度及清晰程度最理想,其次为8—羟基喹啉,浓度为: 0.004M的(Ⅱ)效果比较好。秋水仙1碱处理的则效果较差,
尤其是浓度为0.l%,0.2%(Ⅵ)的效果最差,处理后染色体分散度低。

  三种染料比较结果认为,用铁矾苏木精染色,细胞质和染色体的暮色程度差别大,在细胞中,染色体的色泽较突出,便于观察计数。用地衣红染色的细胞,色泽虽较深,但细胞质和染色体二者的暮色程度开差不明显,进行观察和计数时·没有前者方便。用洋红染色的细胞,染色体和细胞质的着色程度相近,不易观察计数,另外即使增加染色时间,染色体着色程度变化也不大。
  (五)染色体永久玻片几种制作方法的比较。
  镜检后,对细胞染色体清晰的玻片,制作永久片子,采用如下方法:
  1、低温冻结法:
  将片子放在温度为-5℃的冰箱冻结器内。待玻片表面出现冰花后,迅速地用刀片将盖
玻片和载玻片分开,然后放在常温下阴干,一般经过二十四小时左右,最后进行脱水——透明——封片。
  2、粘贴冻结法:
  用一滴梅耶氏蛋白粘片剂(Mayer’salbumenfixative)涂抹在载玻片上后,将各种染色好的材料放在上面,进行压片观察,经镜检后,认为理想的片子。放在冰箱内冻结处理。(处理方法同低温冻结法),然后进行脱水透明封片。
  沙上述二种的方法比较看,粘贴冻结法,因粘贴剂的作用,在脱水透明时,玻片上的材料不易脱落,能比较完整地保持材料的原样。而采用低温冻结法处理的玻片,在脱水透明时,玻片上的材料易落入酒精溶液中,致使材料残缺不全,影响制片效果。

                  参考文献

  (1)郑国钽(一九七八年七月第一版) 《生物显微技术》。
  (2)潘一乐(一九八O年)《桑树根尖细胞染色体的检查技术》,蚕业科学,第六卷第三期。
  (7)邹伟明(一九八O年)《观察桑树染色体的制片技术》,蚕桑通报第三期。