邓 文
(湖北省农科院蚕业研究所 武汉430070)
摘 要 本文介绍了生物技术主要是细胞工程和基因工程在桑树上的应用情况,并展望了生物技术在桑树的应用前景。
关键词 桑树 生物技术
生物技术作为一门高新技术应用于农业方面以来,在研究种质遗传基础、繁殖优良种
苗、改进育种手段、培育新型物种、改良品种特性等都取得了可喜的成果和效益,桑树生
物技术方面的研究虽然起步较晚,但在细胞工程和基因工程研究方面取得了较大的进展。
1 细胞工程—一组织培养和原生质体的培养
1.1 桑树组织培养
桑树组织培养的研究开始于六十年代末,七十年代进行离体器官和愈伤组织培养,八十年代进行了花药、花粉、子房的离体培养,进入九十年代在桑树组织培养实用化方面进行了研究。通过近三十年的研究,目前已建立了较完整的桑树组织培养技术体系,已能对桑冬芽、腋芽、茎尖、胚种、子叶、花药、子房、花穗、胚和叶片等器官或组织进行离体培养并获得完整植株。
桑树组织培养需经过无菌外植体的获得、外植体的培养及芽的增殖、生根培养、试管苗的驯化四个阶段。组织培养操作的技术要点在于:一是通过消毒灭菌和隔离防菌等方法创造无菌条件,二是培养材料的选择、培养基的组成、激素的应用、培养方法和培养条件的选择等。
桑树组织培养取得成功的例子有:
花药与胚的培养:将桑树的花药、胚或未受精子房接种到适宜的培养基上,可诱导形
成愈伤组织或产生胚状体,进一步培养后可形成完整的植株,应用花药和胚培养技术有助于桑雌雄配子发育机理的研究可获得单倍体桑树植株,加倍后还能得到纯合二倍体的桑树新品系,对扩大育种素材和提高育种效率都有积极的意义。林寿康(1984)首次成功地获得桑树花药培养的单倍体植株。林寿康(1989)获得未受精子房培养的单倍体植株,陈爱玉等(1989)用桑幼胚培养并得到完整的再生植株。
桑芽培养:用桑的顶芽、腋芽、冬芽在含有植物激素(生长素、细胞分裂素)的MS培养基上给予适当的温度和光照,可以获得植株,日本冈成美、大山胜夫(1974、1975、1978)、我国的闵世奎等(1991)、马凤桐(1982)对桑芽进行培养均获得了再生植株。
愈伤组织培养:通过多年的研究表明,桑树植株上的任何器官组织均可诱导形成愈伤
组织,通过植物激素的调整和培养条件的改善,能成功地从愈伤组织诱导出不定芽和不定根,再生成完整植株。押金(1985)通过下胚轴培养获得的愈伤组织分化出不定芽,获得
了桑的再生植株。山本等(1986)成功地进行了大规模愈伤组织液体培养。冈等(1995)进行了利用水平震荡高效率形成多芽体的试验。由于愈伤组织在培养过程中容易发生突
变,所以通过辐射、诱变剂的处理,可望增加突变机率,开辟桑树改良的又一新途径。
叶片培养:桑树在自然条件下一般不形成不定芽,但桑叶片组织在离休培养时可直接诱导分化出不定芽,甚至花芽,最终获得再生植株。叶片培养不仅可用于叶形态建成的研究和快速育苗及品种保存,而且有助于桑树基因工程研究的开展,孔令汶等(1990)以MS为基本培养基,对12个桑品种做了培养试验,均从培养的叶片上分化出不定芽,经进一步培养和发根处理后形成了完整的植株。谈建中(1994)、Katagivi等(1994)、王勇等
(1996)、足立等(1997)、楼程富等(1997)分别就培养基成分、培养方式对叶片不定芽诱导率的影响进行了进一步的研究。
1.2 原生质体培养及细胞融合
细胞原生质体经培养可以再生植株,可以吸收外源遗传物质,为桑树育种获取远缘
杂种、新种,提供新的途径,同时原生质作也是细胞生物学、植物生理学、遗传学、病理学和分子生物学等基础研究的很好的实验材料。原生质体培养需经过原生质体的获得,细
胞壁再生,细胞分裂和形成细胞团四个阶段,再由细胞团进而分化形成不定根和不定芽,
进一步发育形成原生质体植株。在桑方面,桑原生质体的材料,来源较广泛,但一般使用的是无菌苗培养的苗叶、悬浮细胞和愈伤组织,通过酶分离降解细胞壁来获得原生质体,桑原生质体一般采用液体浅层静止培养法,培养温度为25士1℃,培养前期需保持在黑暗条
件下,一般培养10天后可移至弱光下培养,原生质体的接种密度一般在5×10-5×105/
ml范围较为适宜。大山(1977)首先成功地分离到了桑叶的原生质体。片桐幸逸(1988)以
叶肉为外体分离到原生质体,再进行培养,并看到了细胞的分裂。夏本末男等在“剑持”桑的原生质体培养中,形成了愈伤组织并分化出了根,但未获得植株。我国学者陈爱玉等对桑原生质体的分离方法及有关条件进行了研究,证明桑子叶和桑幼叶都是获得大量原生
质体的好材料。卫志明(1992)、陈爱玉(1995)
通过桑叶肉原生质体离体培养获得了再生植株。
细胞融合是指两个原生质体融合成一个并形成杂种。利用原生质作融合可以克服远缘种、属间的杂交不亲和,与异种原生质体融合形成的体细胞杂种是自然杂交和人工常规杂交所无法得到的;也可克服近缘种、属间生殖器官异常,不能顺利完成的有性生殖过程;
还可对细胞质基因控制的性状进行改良。在桑的原生质体融合方面,大西敏夫(1987、
1989)通过聚乙二醇对不同桑品种以及桑和楮的原生质体融合的条件和方法进行了探索性试验研究。除聚乙二醇能诱导原生质体融合外,大西敏夫(1989)还通过物理手段,采用
电场对分离好的桑和楮叶的细胞原生质体悬浮液进行处理,也出现了完全融合。
2 基因工程
基因工程是从分子水平上用人工方法,有目的地将外源基因或DNA导入桑树细胞内,并与染色体整合、表达、遗传的综合生物技术。将外源基因导入植物组织或细胞的方法大致可分为直接导入法和间接导入法。间接导入法也称农杆菌介导转化法,是目前桑树转基因技术中应用最普遍的方法,它主要利用土镶农杆菌中的Ti质粒作载体,将T-DNA区域中的致肿瘤基因切除,换上目的基因和标志基因,并通过叶盘、愈伤组织或原生质体等与农杆贸共培养,筛选后使外源目的基因间接导入植物组织或细胞。直接导入法
主要方法有PEG介导转化法、基因枪转化法、显微注射转化法、电击法等等。桑树基因转移技术(以农杆菌介导转化法为例)的主要步骤为共体构建、叶盘转化、不定芽诱导培养和活性检测四个阶段。虽然桑树基因工程研究起步较晚,但近些年也取得了一定的进展,平野(1985)证明桑树是易感染土壤农杆菌的植物。町井(1989)利用PBll21载体,通过叶盘法将卡那霉素抗生基因和GUS基因导入桑叶片组织,经培养后诱导出含GUS活性的再生植株,首次成功地对桑导入了外源基因。
迄今已有下列基因被转移成功,吴成仓(1992)人工合成天蚕抗菌肽B基因、管志文
(1994)人工合成柞蚕抗菌肽D基因、小山等(1997)水稻几丁质酶基因、谈建中等(1998)大豆球蛋白基因。
3 生物技术在桑树上的应用前景 生物技术在桑树上的应用初步研究表明,桑树组织或细胞是外源基因的良好受体,
通过组织培养后这些受体也能再生植株,当外源基因导入桑树成功后,不仅可以通过无性繁殖将有关性状传递给后代植株,而且可通过杂交的方法进行基因重组,进而在桑树种子内积累多基因。另外由于桑叶不进入食物链,在申请田间试验和通过安全性审查等方面比其它农作物有利。随着生物技术的不断完善和发展,它在桑树上的应用在以下几方面将有广阔的前景。
3.1 工厂化快速无性繁殖无毒种苗
在人工控制的实验室培养条件下,植物腋芽的切断繁殖速度和繁殖系数均大大超过常规的农艺方法。目前世界范围内,组织培养成功的植物有600多种,其中有些作物、林
木、瓜果、花卉、蔬菜等实现了工厂化生产,预计未来10年,对试管苗的需求量将以每年7
-8%的速度递增,二十一世纪它将成为发展
”农业生产的新兴产业之一。桑树组培苗的生产技术已基本趋于成熟,只要再使组培苗的生产成本进一步降低,组培苗的驯化操作简
化,桑苗的繁殖就能进入工厂化生产。
3.2 利用基因工程技术改良桑树的叶片品质及边境适应性
其一是改良桑树桑叶品质,主要是利用基因工程的方法提高桑叶的蛋白质含量和质量。由于桑叶中蛋白质和氨基酸的营养情况直接关系到茧丝生产,通过将某些蛋白质基因或氨基酸基因转入桑树后,可以在提高桑叶蛋白质含量的同时改善蛋白质氨基酸的组成,使桑叶中蛋白质种类更接近蚕有机体的蛋白质组成,使得蚕儿能更有效地利用桑叶,从而提高茧丝产量和质量。
其二是改良桑树的抗逆性状,主要是抗病虫害、抗旱、抗盐、抗寒、抗除草剂等。随着生物技术的发展,转移病毒外壳蛋白基因、病毒卫星DNA、反义CDNA基因,设计核酸酶
剪切病毒RNA等技术获得了突破性进展,使人类不但可以从生物体内分离出目的的基因,还可以合成、修饰、拼接目的基因,加上业已成熟的植物细胞原生质体培养技术,使得有益基因在动物、植物和微生物之间的“广泛交流”成为现实,如抗病毒、抗虫、抗除草剂、
抗冻等基因分别被转入到水稻、棉花、烟草、马铃薯、番茄、大豆、杨树、柑桔等植物中,极大地提高了这些植物的抗逆性。因此通过类似的技术将使桑树的抗逆性状得到改良,从而拓展桑树的生长范围、延长生长时间、降低桑园生产管理成本,提高蚕桑生产的经济效益,从而使具有悠久历史的蚕桑生产焕发出新的生机。
3.3 利用桑树组织细胞培养系统表达外源基因,大量生产重组蛋白
3.3.1 利用转基因桑树生产药用蛋白
由于植物细胞培养条件简单且易于成活,便于遗传操作,而且植物病毒不感染人类,所以利用转基因植物生产药用蛋白具有常规的微生物发酵生产系统和动物细胞培养系统无可比拟优越性。转基因桑树也可用于这方面生产。
3.3.2 利用侵害桑树叶片的病毒为载体生产目的蛋白
可以将目的基因插入病毒基因组中,然后把重组病毒接种到桑树叶片上,任其蔓延至所有叶片,外源基因则随病毒的复制而得到高水平的表达,这样桑树就成了生产目的蛋白质的“绿色工厂”,从已感染病毒的叶片中提取病毒蛋白,酶解后可得到目的蛋白,由于病毒蛋白一般可以占到感染叶片总蛋白量的50%,利用这个方法可大大提高外源基因的表达量。用植物病毒做载体生产药用蛋白极有希望成为蛋白的主要来源和生产方法。而桑树由于是多年生植物,且以叶片为收获产物,当桑叶感染到带有目的基因的病毒后,可以多年长时间收获病叶,这同其它一年生植物相比具有一定优势,这种生物技术在桑树上的应用具有极大的前途。
参考文献
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