昆虫抗菌肽研究进展

 

郝  瑜    吴洪丽
(湖北省农科院蚕业研究所 430070)


  昆虫抗菌肽是昆虫在血淋巴中合成的一种小分子肽类。当昆虫受到外界抗原〔微生物及类似物)刺激后,抗菌肽会大量产生。据报道它的产生与诱导源是非专一性的,注射各种诱导 源一定时间后,都能在昆虫血淋巴中检测到抗菌肽。抗菌肽具有分子量小,热稳定性强,水溶性好,强碱性、抗菌广谱等特点。对细菌、真菌、病毒及各种肿瘤细胞都具有杀灭作用。因此,自1980年Boman首次在 惜古比天蚕中分离纯化出天蚕素以来,已先后在各种昆虫中发现了多种抗菌肽,同时在其它许多无脊椎动物和某些脊椎动物中,也发现了抗菌肽的类似物,被认为是从细菌到高等哺乳动物都普 遍存在的一类防御性多肽[1][2]。近年来,有关抗菌队的作用机理、抗菌肽基因工程以及抗菌肽在动、植物转基因工程中的应用等研究十分活跃,受到 了人们的普遍关注。


  1 昆虫抗菌肽的种类


  根据抗菌肽的结构及功能的不同。分为天蚕素类(cocropins)、昆虫防御素(insectdefensins〕、富含哺氨酸的抗菌肽(prolinerichpeptides)、富含甘氨酸的抗菌肽(glyslne一richpeptides)4类。
  1.1 天蚕素类
  天蚕素类抗菌肽.主要在鳞翅目及半翅目昆虫中发现。Boman(1981)用大肠杆菌注射惜古比天蚕蛹,从血淋巴中分离纯化得到天蚕素A.B,并测定”一级结构。天蚕素的一级结构是由31-39个氨基酸组成,分子量为4KD左右,具有强磁性的N端和疏水性强的端。Hahik(1988)利用二维核磁共振技术测定天蚕素A的 三级结构,认为其分子结构含有两段a一螺旋,其中N端的a一螺旋对水和脂都具有亲和性,称为双亲的a一螺旋,C端的a一旋为疏水性强的a一螺旋。在两段a一螺旋之间,具有一个结合部,这种结 构与天蚕素的抗菌活性密切相关[3][4]
  1·2 昆虫防御素
  昆虫防御素最先是在肉蝇中发现, 它与在哺乳动物嗜中性白细胞中分离到的防御素极为相似。随后在昆虫纲中有30多种防御素被发现。大多数昆虫防御素由38一43个氨基酸组成,分子量4KD左右。分子由 三个结构域组成:一个柔韧的N瑞环.一个双亲的a-螺旋中心和一个带有拟β转角的 反向平行的β片的C末端,6个保守的半胱氨酸、以3个二硫键整个分子结构得以固定。不同种类的防御素分子结构具有很大的同源性,其主要差异只是在N瑞环的 大小[5]
  l.3 富含哺氨酸的抗菌肽
  富含哺氨酸的抗菌肽首在从意大利蜂中发现,随后在其它一些昆虫中选相继发现。这类肽由15-34个氨基酸残基组成、其中哺氨酸含量在25%以上,一级结沟的最大特 点是在N端有一个富含Pro的P结构域,其余部份为富含Gly的G结构域[6]
  1.4 富含甘氨酸的抗菌肽
  富含甘氨酸的抗菌肽,有一个最大特点就是一级结构中富含甘氨酸,有的是全序中富含甘氨酸,有的是某一序列中富含甘氨酸。Casteels (1993)从意大利蜂的血淋巴中分离出一种富含甘氨酸的抗菌肽,。一级结由93个氨基酸组成,分子中 Gly的含量达 19%。


  2 抗菌肽的抗菌机制


  不同类型的抗菌肽,由于结构不同,其抗菌机制也不完全一样。天蚕素类抗菌肽,对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有抑杀作用,其抗菌机理一般认为:天蚕素分子在静电作用下,大量聚集在细菌细胞膜上,首先抗菌肽的疏水a一螺旋插入疏水的细菌细胞膜,随后双亲的a-螺旋也插入细胞膜中,形成离子通道,导致细菌细胞内容物外流,细胞内ATP合成下降,细菌停止 生长而死亡[7][8][9]。昆虫防御素只对革兰氏阳性菌具有抗性,对革兰氏阴性菌几乎无作用,同时,对真菌及真核细胞也不起作用。其抗菌机制首先是其双亲的a-螺旋在细胞膜上聚集形成寡聚体,并在细菌细胞膜上围成一个离子通道,导致细胞内K+大量外流,细胞内ATP合成下降而死亡。其分子结构中的二 硫健在抗菌作用中至关重。富含氨酸的抗菌肽对革兰氏阴性菌有抗性,对革兰氏阳性菌无作用,其抗菌机理目前尚不清楚,推测分子中大量存在的Pro对抗菌作用具有重要意义[10]。富含Gly的抗菌肽,对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌都有良好的抗性,同时对人和哺乳动物的许多病原菌具有抗性,推测该类抗菌肽分子中大量的Gly对增强肽链的弹性,形成多变的空间结构对其广谱的抗菌性起着重要作用[11]


  3 抗菌肽对病毒及肿瘤细胞的作用


  昆虫抗菌肽除具有广谱的杀菌作用外,对各种病毒及肿瘤细胞也有强烈的抑杀作用。Outh等(1991,1993)报道,烟芽夜蛾的血淋巴对6种DNA、RNA病毒具有明显的抑制作用[12][13]。 Wachinger(1998)报道,蜂毒素和天蚕素在亚毒性浓度下可抑制艾滋病毒(HIV-1)的基因表达[14]。国内学者也有柞蚕素在鸭体内抑制鸭乙型肝炎病毒DNA复制增殖的报道。在抗肿瘤作用方面,韩献萍(1993)报道纯化的柞蚕抗菌肽能使宫颈癌细胞发生一系列病理改变[15]。郭玉梅等(1995)报道,家蚕免疫血淋巴在浓度稀释1倍时,对小鼠腹水型宫颈瘤(U14)的抑制作用可达50.88%,对S180肉瘤和EAC艾氏瘤的最好抑制率分别达到35.58%和34.79%[16]。贾红武等(1996)用电镜观察家蚕抗菌肽对癌细胞和正常人B淋巴细胞超微结构的影响,发现抗菌肽对K562(人骨髓样白血病细胞)有明显的杀灭作用,而对正常人的B淋巴细胞无不良影响[17]。张卫民等(1998)报道了柞蚕免疫血淋巴及纯化的抗菌肽D对直肠癌HR8348及肝癌细胞BEL-7402的杀伤作用[18][19]。由于抗菌肽对肿瘤细胞有选择性的杀灭作用,它极有可能成为无毒或低毒副作用的抗肿瘤新药。


  4 抗菌肽的基因工程研究


  研究表明,抗菌肽基因是一个典型的真核基因,具有一个CAAT框,一个TATA框,一个昆虫特异的帽子位点和多聚核甘酸加尾序列AATAAA,并有内元和假基因。迄今为止,多种抗菌肽分别在昆虫系统、酵母系统以及真核系统、原核系统中表达成功。Jaynes(1989)将天蚕 素B基因以融合方式在大肠杆菌中表达[20],Hellers(1992)将天蚕抗菌肽A基因cDNA克隆到 苜蓿斜纹蛾核多角体病毒(ACNPV)启动子的下游,获得重组病珠,将其感染粉纹夜蛾幼虫和天蚕滞育蛹,目的基因得到高效表达[21]。Reichhart(1992),建立起绿蝇防御素A基因在酵母中的表达系统[22]。国内 叶玉坤(1994)将柞蚕抗菌肽 D基因在酵母中成功表达[23],徐飞等(1998)将人功合成的柞蚕抗菌肽D基因,克隆到Bluescript/MB质 粒和过度质粒CO24,再将其转入根瘤农杆菌SE,用它感染烟草、番茄叶片时出现愈伤组织[24]。谢维等(1996)选用大肠杆菌偏爱的密码子,首次合成了家蚕抗菌肽CMIV基因,将其克隆到金黄葡萄球菌A蛋白与IgG亲和结构域ZZ的融合表达载体中,再转化大肠杆HB101,得到ZZ-CM4融合蛋白的表达,经切割裂解后,重组的CM4表现出较强的抗菌和抗肿瘤活性[25]。郑青等(1999)以酵母偏爱型密码,采用化学合成结合PCR法合成天蚕素AD基因,并在酵母中获得表达[26]
  抗菌肽在动植物转基因工程中的应用,近年研究报道颇多。Destenfano一Beltan和Jaynes等(1991)将 Shiva—1和 SB-37转入烟草 和马铃薯,获得抗青枯病的转基因烟草,但转马铃薯的抗青枯病的能力未见提高[27][28]。管志文(1994),王勇(1998)分别报道柞蚕抗菌肽D基因转入桑树,获得桑树的抗病植株[29][30]。在动物方面,Reed(1998),将Shiva la基因转入小鼠,结果转基因鼠对布氏杆菌病的抵抗力明显增加[31],Winder等(1998)将天蚕 素基因导入人膀眈癌衍生细胞,发现其对小鼠的致癌力丧失或减弱[32]


  5 昆虫抗菌肽研究前景


  利用昆虫抗菌肽具有强烈、广谱杀菌能力以及对病原物选择性杀灭特点,在生物防治以及医药研究方面,可根据抗菌肽特殊杀菌机制,生产新的抗菌药物,解决传统药物的“耐药性”问题;在动植物育种方面,可通过转基因工程,获得新抗病品种。特别是近年来抗菌肽基因人工合成,以及在酵母菌等微生物中的高效表达,为抗菌肽应用研究开辟 了更加广阔的前景。(主要参考文献略)