李木旺 侯成香 姚 勤 陈克平
(中国农业科学院蚕业研究所江苏镇江 212018)
当脊椎动物被抗原入侵时,在其肝、脾和淋巴结等组织的网状内皮系统的细胞会分泌出抗体,对入侵的抗原起免疫反应,从而使自身不被病原所感染。细菌、病毒等是常见的抗原,而生物大分子如多糖、核酸和蛋白质
均能作为抗原。
由于抗体只能与引起它产生的相应抗原发生免疫反应,具有高度的特异性,因此抗原一抗体反应被广泛运用于疾病的检查与诊断、不断来源物种间的血清学关系等方面的研究。
对家蚕来说,对病原的抵抗性主要依靠家蚕的体壁和消化管的防御作用、血细胞中浆细胞和颗粒细胞的吞噬或包围作用、体液中能形成黑色素的酚氧化酶系统等。同时,已有的研究显示,在家蚕体腔内注入病原后,
也能在体液中诱导产生抗菌物质,但产生的抗菌物质浓度较低。利用高等动物对抗原免疫产生的抗体量大而且抗原一抗体间免疫反应的特异性,在蚕病学的研究中,被应用于蚕病的
早期诊断、不同来源病原间的血清学关系的研究等。
1 蚕病的种类
蚕病分传染型蚕病和非传染型蛋病两类,传染型蚕病对蚕业生产的危害相当严重,主要包括真菌病、细菌病、病毒病、微粒子病等。而危害最为严重的是病毒病和微粒子病。当
蚕病发展到肉眼可见病症时,一般来说损失是比较大的,尤其微粒子病能够通过胚种传染,不仅影响当代,还会对下一代造成致命影响。每年全国因微粒子病而烧毁的蚕种的损失惨重。
因此、建立蚕病的早期针断技术是防治蚕病造成蔓延的有效措施之一。近几十年来.国内外的一些学者在运用血清学方法对蚕病的早期诊断作了很有价值的探讨。
2 抗血清的制备方法
选用健康成年家免,体重2.5公斤左右,每月注射抗原一次,一般注射3次,抗原最由少到多(如 CPV可分别为 160,235,309ug)。可采取肌肉注射、皮下注射或静脉注射的方法。全部注射完毕后,从耳静脉
(或动脉)采血少量,离心后取血清,测其抗体效价,若效价在10000以上,则从心脏取全皿,否则追加一次病毒。
3 家蚕蚕病的早期诊断
3.1 对家蚕核型多角体病毒病(BmNPV)的早期诊断
家蚕核型多角体病毒病又称血液型脓病,病原为杆状病毒科,遗传物质为双链DNA,寄生于血细胞和体胶易感组织的细胞核内。该病为亚急性传染病,
稚蚕一般3一4日发病死亡,壮蚕一股4一6日发病死亡。荒川(1983.1989)分别用酶标抗体法。胶乳凝集反应法等方法进行了NPV病的早期诊断.获得了良好的结果、在添
食两天后能够检出阳性反应。
3.2 对家蚕质型多角体病毒病(BmCPV)的早期诊断
由家蚕质型多角体病毒感染所引起的蚕病又叫中肠型脓病,病原为呼肠孤病毒科。遗传物质为双链RNA,寄生于中肠圆筒型细胞的细胞质中。该病病势缓慢,病程长,是我国最早用来做血清学
蚕病诊断的蚕病病毒。
胡雪芳等(1979)用纯化后的病毒注射家免,获得效价为2048的免疫兔血清。对经BmCPV感染后不同时间的家蚕进行对流免疫电泳法检测,发现在感染后12一20小时
(即在病原的增值初期)便可检出、而常规检测需感染后5-7天才能确诊。同年,黄可威等探讨了用反问简接血凝法检测家蚕中肠型脓病。三毛明人等(1984)作成 BmCPV的单克隆抗体,伊藤等
(1985)运用获得的纯化的单克隆抗体JgG,用ELISA(Enzymelinked
immunosorbent)方法对蚕粪中的CPV进行检测,在添食2天后的检出率为77.5%,从而能够在不对
蚕体造成伤害的情况下对CPV病作出早期诊断。
3.3 对家蚕病毒性软化病(BmFV)的早期诊断
家蚕病毒性软化病病毒(BmFV)是一种细小病毒,其遗传物质是单链RNA,专一寄生在家蚕中肠杯形细胞的细胞质中。该病病程长,其病
症在感染当龄无明显症状,约3天后才会出现不明显的病症,用肉眼和显微镜均难以准确诊断,往往要采用生物测定和组织染色等方法予以确诊。钱元俊等(1981)对该病的血清学
诊断作了较详细的探讨,采用双向扩散法和对流免疫电泳法及荧光抗体法,能在感染后16一24小时检测出该病毒,若添毒量少,并且饲育温度低的情况下,则要到48小时后才能检出。清水等
(1982)用ELISA方法检测FV,发现其灵敏度比用免疫扩散法、成环试验、胶乳凝集法分别高6000、1700、200倍。
3.4 对家蚕浓核病(BmDNV)的早期诊断
家蚕浓核病也是一种细小病毒,其遗传物质为单裢DNT,寄生在家
蚕中肠圆筒形细胞的细胞核内。该病的病程长,外部症状与病毒性软化病极为相似,与病毒性软化病和细菌性肠道病不易区别。佐藤(1975)阿部等(1987)分别采
用荧光抗体法和酶联法对该病进行了诊断方面的研究。王裕兴等(1983)在已成熟的对流免疫电泳法基础上,将免疫酶联技术应用到该病的早期诊断中,发现酶对流免疫电泳检测灵敏度比对流免疫电
泳提高8倍,对组织的稀释倍数可比对流免疫电泳低16倍,最早检出时间为16小时,半数检出时间为21小时。均比同样条件下的对流免疫电泳提早8小时左右。钱元俊等
(1984)进行了蚕病毒病血清诊断实用化研究。研制了抗血清滤纸及其干燥保存的条件和方法;郭锡杰等 ( 1985 )研究了用酶标组化法进行广DNV病的早期诊断,钱元
俊等(1989)进行了多种血清学诊断家蚕浓核病方法的比较研究,包括双向免疫扩散法(DID)、对流免疫电泳法(CIEP)、酶联对流免疫电泳法(ELCIEP)、酶标组化法
(IEHC)、可溶性酶一抗酶法(PAP)、斑点免疫结合测定法(DIBA)、生物素一亲和素系统检测法(ABS)以及胶乳凝集试验法(LTA等,应用这些方法可以检测出的纯化BmDNV的
量为1×10-1-1×1O-4O.D,以DIBA法检测灵敏度最高。分别为LAT法.ELCIEP法,CIEP法的10倍,160倍,10O0倍。检测蚕体DNV时,可在接种后8一40/f时检出,以ABS法
检出出阳性反应最早,而在同样条件下,常规险测要确诊DNV病需 5一7天。
3.5 家蚕微粒子病(Nosema bombycis N.B)的早期诊断
家蚕微粒子是一种原生动物、其一生要经过孢子发芽、营养增值、孢子形成三个时期。孢子是休眠阶段,蚕病的发生主要是孢子传染引起。家蚕微粒子病是一种慢性蚕病,发病经过时间因感染
早迟、病势轻重而不同.该病最大的危害性体现在微粒子孢子的可通过胚种传染的特性,是蚕种唯一检疫的对象。每年因蚕种微毒而导致的损失巨大。传统的检测方法都是肉眼观察或显微镜
镜检的方法.但都必须在蚕表现出一定约症状之后。采用血清学诊断断的方法。可以在感染初期即可捡出。藤原(1981)采用间接荧光抗体检验技大成功检测家蚕微孢子。黄自然等(1983)用
荧光抗体检验技术对家蚕微粒子的检测作了初步探索,获得的抗体蛋白经异硫氰荧光素标记结合,分别用直接法和间接法成功进行了微粒子的早期诊断。李达山(1985)用玻片凝集
反应的方给对微粒子进行了检测试验,取得较好的结果。徐兴耀等(1998)利用新发展起来的单抗金银染色法进行了家蚕微粒子的检测研究,使用新构建的家蚕做孢子虫的单克隆抗体,结合免疫金银染色(ICSS)法,并设计了6种温度和5种时间对家蚕
微孢子等9种微抱子检测,结果表明该细胞株单抗直接IGSS法的最佳工作条件是:胶金标记pH6.2一6.5,金标抗体染色 37°C,保温
30分钟,经显影后光镜观察,检测微孢子周边被染上棕褐色,其它类型抱子呈无色或浅褐色。并认为抗原涂片后用甲醇固定效果最好。
4 家蚕病原的血清学分类
由于病原的亚类之间用常规的方法很难区别开,如微粒子有很多种,有的微粒子虽然外形酷似家蚕微粒子,但其不~定能胚种传染。利用抗原一抗体之间的特异性反应.完全可以将它们区分开,从而以免错杀、家蚕病原的血清学分类目前主要应用于浓核病
病毒和
微粒了的分类上。
4.1 BmDNV的血清学分类
家蚕浓核病是在家蚕4类病毒中最晚发现的,渡部等(1986)对在日本发现的伊那株、山梨株和佐久株等浓核病病毒进行了血清学分类,结果发现山梨株和佐久株的血清学关系完全相同,而与伊那株的差异较大。因此他把伊那株BmDNV称为BmDNV—l型,而把佐久株和山梨株合并称为BmDNV-2型。钱元俊等将中国(镇江)株(BmDNV-Z)和日本的BmDNV-l和 BmDNV—2作了血清学关系的研究,结果发现BmDNV-Z类似于BmDNV—2而不同于BmDNV-1。
4.2 不同来源微粒子孢子间的血清学关系
佐藤等(1981)应用血清学方法进行了8种微孢子的比较,其中4种(NO.102,NO.408,NO.520,NO.611)
血清学关系同,而其余3种(Mll,M12、M27)只能与各自自身的抗血清发生凝集反应。韩明世、渡部(1987)分别用酶标抗体法、PAP法对蚕蛾镜检中的微粒子进行鉴别。郭锡杰等(1994)应用玻片凝集法和酶标抗体法比较了4种不同来源的微粒子间的血清学关系,结果表明,从安徽绩溪和江苏东台收集的微
孢子和中国农科院蚕研所保存的家蚕微孢子具有相同的血清学关系,而蓝叶虫微孢子与上述三种孢子间没有血清学关系。
利用抗原一抗体间的反应的特异性和灵敏性,可以在家蚕感病后的较短时间内检出病原,从而能够及时采取措施,减少和挽回损失。对于微粒子病来说,利用其可以在很低浓度下能够检出阳性反应的特点,可以用于补正检查和预知检查,有利于蚕种场对微粒子病的预防,这些优点使得免疫学方法在蚕病学上的应用有着广阔的前景。但到目前,用血清学方法检测家蚕病原尚未得到充分的运用,仍然停留在实验室阶段,主要是由于该方法成本较高,操作比较繁琐,需要电泳仪等仪器。所以说,若能寻求到一种在不降低其灵敏度的情况下,能够快速、方便、价格低廉的血清学检测方法,对于蚕业生产,尤其是对蚕种生产来说,将能产生降低风险,提高效益的作用。
主要参考文献
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